棉花

　　CRISPR/Cas系統(tǒng)是目前發(fā)現存在于大多數細菌與所有的古菌中的一種免疫系統(tǒng)，被用來識別和摧毀抗噬菌體和其他病原體入侵的防御系統(tǒng)。然而，目前的9系統(tǒng)會產生脫靶效應，導致一些不理想的結果。之后，一種新型的Cas蛋白（Cas12a/Cpf1）的出現擴展了基因編輯所依賴的Cas蛋白的種類，這個新型蛋白與之前CRISPR／Cas9基因編輯系統(tǒng)相比，具有編輯過程簡單，分子量小，更特異的PAM序列，剪切位置不同，產生粘性末端及脫靶效率低等優(yōu)點，因此，由它介導的CRISPR-cas12a系統(tǒng)作為一類新型的基因編輯工具，在植物的基因編輯中廣泛引起人們的關注。

　　2019年5月5日，Plant Biotechnology Journal 雜志在線發(fā)表了華中農業(yè)大學棉花遺傳改良團隊題為“Robust CRISPR/Cpf1（Cas12a）mediated genome editing in allotetraploid cotton（G.hirsutum）”的研究論文，該論文分析了Cpf1（Cas12a）蛋白在棉花異源四倍體中的編輯作用，具有很高的編輯效率，并且沒有發(fā)現脫靶效應。

　　值得注意的是這是華中農大棉花團隊發(fā)表的第三篇關于棉花基因編輯的研究論文，前兩篇論文分別是：2017年發(fā)表的“High efficient multi-sites genome editing in allotetraploid cotton(Gossypium hirsutum) using CRISPR/Cas9 system”以及2018年發(fā)表的“Whole genome sequencing reveals rare off-target mutations and considerable inherent genetic or/and somaclonal variations in CRISPR/Cas9-edited cotton plants”。

　　棉花是我國重要的經濟作物之一，是天然纖維，植物蛋白的重要來源。目前種植*多的異源四倍體棉花因其龐大而復雜的基因組，大多數基因在At和Dt亞基因組多個同源拷貝，給棉花基因組功能研究帶來巨大挑戰(zhàn)。2017年，華中農業(yè)大學棉花遺傳改良團隊開發(fā)了在棉花異源四倍體中具有高效編輯效率的以CRISPR/Cas9載體，并且能夠穩(wěn)定的遺傳轉化。為了在棉花中進一步開發(fā)效率更高，特異性更強的基因編輯載體，該團隊構建了以Cpf1（Cas12a）蛋白為工具的編輯載體，并在棉花中進行了一系列的驗證。

　　該研究以棉花內源葉綠體形成相關基因（GhCLA）為靶標，通過tRNA-sgRNA轉錄單元構建了基因編輯載體，通過農桿菌介導的轉化獲得了含LbCpf1質粒載體的92株獨立的T0代再生植株。通過Sanger測序和高通量測序（Hi-Tom）檢測產生的轉基因植株的突變。Sanger測序結果顯示，92株T0獨立植株中有80株（有效率87%）在目標位點檢測到突變，另一方面，Hi-TOM數據顯示，每個單獨的植物包含不同的編輯程度。表明LbCpf1在棉花植株中具有較強的編輯活性。在所有被編輯的植株中，突變程度在1~94.12%之間，其中在At和Dt亞基因組同時編輯的有編輯68個樣本，僅At或Dt亞基因組編輯6個樣本；作者根據sgRNAcas9_3.0.5軟件確定了*具潛力的六個脫靶位點，利用T1植物的位點特異性PCR產物進行Sanger測序，檢測這些潛在的脫靶位點后并未檢測到脫靶效應；同時發(fā)現CRISPR/Cpf1系統(tǒng)在棉花中更傾向于在目標位點誘導DNA缺失，而不是堿基替換或插入。因此，在棉花基因組編輯中，CRISPR/Cpf1系統(tǒng)更傾向于產生大規(guī)模缺失，說明LbCpf1系統(tǒng)特異性強，是棉花基因組編輯的良好選擇。

　　華中農業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室金雙俠教授為該論文的通訊作者，博士生李波和已畢業(yè)的碩士芮杭萍為共同*作者，張獻龍教授也參與了這項工作。該研究受到國家重點研發(fā)計劃（2016YFD0100203-9）和國家科技部轉基因專項（2018ZX08010-05B）和中央高校科研經費（2013PY064,2662015PY028，2662015PY091和0900206328）的支持。

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